2016年12月2日，國(guó)際頂級(jí)期刊Science刊登了北京大學(xué)藥學(xué)院天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任周德敏教授/張禮和院士課題組題為“Generation of Influenza A Viruses as Live but Replication—Incompetent Virus Vaccines”（制備復(fù)制缺陷的活流感病毒疫苗）的突破性研究進(jìn)展。北京大學(xué)周德敏教授實(shí)驗(yàn)室的博士研究生司龍龍、徐歡為共同第一作者。

這一研究成果在改變現(xiàn)有的疫苗研發(fā)、生產(chǎn)體系方面具有極大地潛力。通過在天然病毒株遺傳序列中引入過早終止密碼子，使得改造后的病毒在普通細(xì)胞中喪失復(fù)制增殖能力，但卻保留完全的感染活性。研究者利用這種完全活性的病毒制作疫苗，能夠有效誘發(fā)強(qiáng)大的體液、粘膜以及免疫T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)應(yīng)對(duì)抗原性病毒，甚至能中和已受感染者體內(nèi)存在的病毒株。這種疫苗技術(shù)有望成為一種應(yīng)對(duì)幾乎所有病毒的普適性方法，特別是全球眾多致命性病毒。

工作原理：將活體病毒作為疫苗

在保留病毒完整結(jié)構(gòu)和感染力的情況下，使流感病毒由致命性傳染源變?yōu)榱祟A(yù)防性疫苗。這一技術(shù)不僅使疫苗研發(fā)不再?gòu)?fù)雜，而且擺脫了對(duì)病毒生物學(xué)知識(shí)獲得的依賴，并適用于幾乎所有病毒。多數(shù)評(píng)論認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)顛覆了病毒疫苗研發(fā)的理念，成就了活病毒疫苗的重大突破。

“現(xiàn)在的疫苗研發(fā)與生產(chǎn)技術(shù)復(fù)雜，而且是不通用的，比如說做流感疫苗的技術(shù)不能用在其他病毒的疫苗上面。”司龍龍說，這種病毒個(gè)體差異導(dǎo)致的疫苗研發(fā)技術(shù)的復(fù)雜性阻礙了其發(fā)揮更好的作用。

而周德敏教授的課題組所取得的技術(shù)突破，就是使得疫苗的研發(fā)技術(shù)獲得普適性，同時(shí)增強(qiáng)疫苗的效用。周德敏說，課題組以流感病毒為模型，發(fā)明了人工控制病毒復(fù)制從而將病毒直接轉(zhuǎn)化為疫苗的技術(shù)，即“在保留病毒完整結(jié)構(gòu)和感染力的情況下，使流感病毒由致命性傳染源變?yōu)榱祟A(yù)防性疫苗”。這一技術(shù)不僅使疫苗研發(fā)不再?gòu)?fù)雜，而且擺脫了對(duì)病毒生物學(xué)知識(shí)獲得的依賴，并適用于幾乎所有病毒。多數(shù)評(píng)論認(rèn)為，這一發(fā)現(xiàn)顛覆了病毒疫苗研發(fā)的理念，成就了活病毒疫苗的重大突破。

“以（甲型）流感病毒為例，我們?cè)诟牧鞲胁《局械男攀筊NA中引入了一個(gè)‘終止密碼子’，并保留病毒的完整結(jié)構(gòu)。這樣，保留了感染性的病毒進(jìn)入生物體后，可以激活生物體細(xì)胞的全部免疫反應(yīng)；但由于終止密碼子的存在，病毒無法進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯，因而失去復(fù)制能力。”周德敏說。

周德敏團(tuán)隊(duì)利用活體禽流感病毒制作疫苗，并進(jìn)行了包括小鼠、荷蘭豬和白鼬在內(nèi)的疫苗接種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。病毒入侵宿主后，不會(huì)發(fā)生復(fù)制增殖，卻可以誘導(dǎo)集體產(chǎn)生對(duì)抗該病毒的免疫能力。

關(guān)鍵步驟：切斷病毒的復(fù)制程序

在病毒的遺傳密碼中引入終止密碼子，就像是電腦需要執(zhí)行一個(gè)程序，需要各種程序文件，研究人員在其中插入一個(gè)終止程序的文件，一旦程序走到這一步，就會(huì)停止，復(fù)制也就無法進(jìn)行。

制作疫苗，首先是要阻斷病毒強(qiáng)大的自我復(fù)制能力。無論是目前常見的滅活疫苗還是減毒活疫苗，最基本的要求就是病毒在進(jìn)入生命體之后，不能復(fù)制或者低水平復(fù)制。

同樣，該項(xiàng)研究所使用的病毒，也要采取手段切斷其復(fù)制程序，即通過在病毒的遺傳密碼中引入終止密碼子，使得病毒在進(jìn)入人體之后，只能發(fā)揮疫苗的作用，而不能作為病毒橫行肆虐。

據(jù)司龍龍介紹，部分病毒是RNA病毒，即它們的遺傳物質(zhì)是RNA，“DNA是雙鏈結(jié)構(gòu)，RNA一般是單鏈結(jié)構(gòu)，所以RNA沒有DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且RNA復(fù)制酶沒有校正功能，更容易發(fā)生突變，這也是病毒為什么會(huì)很快發(fā)生突變的原因。”

病毒的信使RNA（mRNA）負(fù)責(zé)合成蛋白質(zhì)，其中三個(gè)相鄰的堿基構(gòu)成一個(gè)密碼子，病毒通過密碼子的序列合成蛋白質(zhì)并完成復(fù)制。而在這些密碼子中，有一類特殊的終止密碼子，它們的作用是終止蛋白質(zhì)的合成，病毒一旦無法完成蛋白質(zhì)的合成，就無法復(fù)制。實(shí)際上，一個(gè)病毒如果想要完成復(fù)制，就像是電腦需要執(zhí)行一個(gè)程序，需要各種程序文件，研究人員在其中插入一個(gè)終止程序的文件，一旦程序走到這一步，就會(huì)停止，復(fù)制也就無法進(jìn)行。

制作疫苗：通過轉(zhuǎn)基因細(xì)胞生產(chǎn)病毒

終止密碼子相當(dāng)于給病毒上了一把鎖。想要將鎖打開，讓病毒恢復(fù)自我復(fù)制能力，需要三把鑰匙同時(shí)發(fā)揮作用，但在人體中，這三把鑰匙都不存在。只有在我們自主研制的細(xì)胞系里，病毒才會(huì)開啟復(fù)制開關(guān)。

整個(gè)研究成果實(shí)際上包含了病毒復(fù)制能力的整套“開關(guān)”程序。關(guān)閉程序保證了病毒在進(jìn)入生物體內(nèi)不能“作孽”，開始程序則要解決該類活體病毒疫苗的生產(chǎn)問題。

課題組成員，北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室博士后李帥說，早在6年前，周德敏就主持了一個(gè)國(guó)家973項(xiàng)目——《基于基因密碼子擴(kuò)展的蛋白質(zhì)標(biāo)記新方法》，該研究成果的核心部分就是運(yùn)用了這種改造密碼子翻譯技術(shù)，并將這種技術(shù)引入病毒體內(nèi)改造病毒進(jìn)而開創(chuàng)了新的病毒疫苗設(shè)計(jì)體系。

開啟已經(jīng)插入終止密碼子病毒復(fù)制程序的就是這項(xiàng)“基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)”。

周德敏說，通過該項(xiàng)技術(shù)，建立了他們自主研發(fā)的疫苗“生產(chǎn)工廠”——位于北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的病毒包裝細(xì)胞系，該細(xì)胞系被人工改造過，提供病毒復(fù)制的必要條件。“終止密碼子相當(dāng)于給病毒上了一把鎖。想要將鎖打開，讓病毒恢復(fù)自我復(fù)制能力，需要三把鑰匙同時(shí)發(fā)揮作用：非天然氨基酸、與這類氨基酸匹配的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）以及tRNA合成酶。在人體中，這三把鑰匙都不存在，因此不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生負(fù)面影響。只有在我們自主研制的細(xì)胞系里，病毒才會(huì)開啟復(fù)制開關(guān)，從而可以復(fù)制出大規(guī)模的帶有終止密碼子的病毒，用以生產(chǎn)疫苗。”

“已經(jīng)插入了終止密碼子的病毒，只有在我們提供的這個(gè)條件中才可能完成復(fù)制，并且復(fù)制之后的病毒仍然帶有終止密碼子，在生物體內(nèi)仍然無法復(fù)制。”司龍龍說。

新技術(shù)用于臨床路還很遠(yuǎn)

中科院病原微生物與免疫國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究人員孟頌東表示，周德敏團(tuán)隊(duì)的研究是一種“全新的、前所未有的方法”，為對(duì)抗病毒指明了新路。然而，他同時(shí)也表示，這種人工改造的病毒有可能發(fā)生意外的突變，打破原本對(duì)其自我復(fù)制性的限制，這將帶來不可估量的后果，尤其是RNA病毒本身的極易突變特性帶來的風(fēng)險(xiǎn)。

外界的另一個(gè)擔(dān)心是，一旦改造后的病毒與天然株病毒之間發(fā)生遺傳重組，會(huì)不會(huì)發(fā)生更可怕的事情，至少目前實(shí)驗(yàn)來看，這種情況還沒有發(fā)現(xiàn)，甚至有更為有趣的發(fā)現(xiàn)，即被插入了終止密碼子的病毒“感染”了天然株的病毒，使得天然株病毒也帶有了終止密碼子，失去了本身的復(fù)制能力。

周德敏對(duì)此解釋道：“病毒一直在進(jìn)行重組。我們的活病毒疫苗進(jìn)入人體后，如果體內(nèi)同時(shí)存在感染的病毒，它們之間會(huì)重組，帶終止密碼子的病毒基因會(huì)進(jìn)入野生病毒的基因中。只需要一個(gè)終止密碼子，野生病毒就會(huì)失去復(fù)制能力。如果流感疫苗里設(shè)置的終止密碼子越多，它們能中和的病毒數(shù)量就越多，也就是說藥性越強(qiáng)。”在周德敏看來，如果未來爆發(fā)大規(guī)模的病毒疫情，運(yùn)用這種方法，人們可以在短時(shí)間內(nèi)生產(chǎn)出大量針對(duì)性藥物。

“整個(gè)研究所帶來的是一種理念的變化，首先是多學(xué)科的交叉，其次，這里面的多項(xiàng)技術(shù)都可能推動(dòng)各自領(lǐng)域的發(fā)展，比如基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)對(duì)于基因藥物的研發(fā)可能會(huì)帶來很大的推動(dòng)作用。”李帥說。

目前，周德敏已經(jīng)為該技術(shù)申請(qǐng)了專利。盡管目前的動(dòng)物試驗(yàn)十分成功，但周德敏表示，他還不清楚針對(duì)該項(xiàng)目的臨床試驗(yàn)何時(shí)能夠得到批準(zhǔn)，“因?yàn)檫@是一項(xiàng)全新的研究，政府機(jī)構(gòu)需要對(duì)此保持慎重的態(tài)度。或許將來的臨床試驗(yàn)會(huì)出現(xiàn)新的問題，現(xiàn)在還難以判斷。”

1. 通過在病毒RNA中插入終止密碼子（UAG），改造病毒。

2. 這枚細(xì)胞是研究組通過基因密碼子擴(kuò)展技術(shù)所制造的細(xì)胞系的特殊細(xì)胞，當(dāng)病毒的復(fù)制程序打開，并且閱讀到終止密碼子位點(diǎn)時(shí)，細(xì)胞會(huì)提供人工氨基酸UAA，讓程序繼續(xù)進(jìn)行，完成復(fù)制，從而可以復(fù)制出大規(guī)模的帶有終止密碼子的病毒，用以生產(chǎn)疫苗。

3. 另一方面，在人體正常細(xì)胞內(nèi)，由于缺乏非天然氨基酸、與這類氨基酸匹配的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）以及tRNA合成酶，病毒無法完成復(fù)制，即不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生負(fù)面影響。

4. 插入了終止密碼子的病毒與野生株病毒進(jìn)行基因重組之后，會(huì)產(chǎn)生同樣攜帶終止密碼子的病毒，其復(fù)制能力也會(huì)喪失。（記者 王騰騰）

活體病毒可做疫苗，是真還是假？

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