在我們從宏觀世界轉到微觀探索時，往往會產生一個疑問：我們究竟能看到最小的東西極限是什么？從最早的顯微鏡發明以來，人類第一次看到了細胞和微生物的世界。然而傳統光學顯微鏡的分辨能力存在一個極限，大概為200納米。這個限制是因光的波長而決定的，任何比這個尺度更小的細節都難以被傳統顯微鏡分辨。這種限制被稱為阿貝衍射極限，由德國物理學家恩斯特·阿貝提出。當光通過一個細小的物體或狹縫時會發生衍射，也就是光線在遇到障礙物的邊緣時產生偏折，從而使得光無法完全聚焦到極小的點上。光的波長越長，其衍射效應越明顯。可見光波長范圍大約在400到700納米之間，這意味著當觀測物體的細節小于光波波長的一半時光波就無法分辨這些細節，光學顯微鏡也就無法聚焦或解析出清晰的圖像。

圖 衍射極限示意圖

由于這一原理，即使采用高質量的鏡頭和強光源，傳統光學顯微鏡也無法突破這一分辨率極限，對于科學家而言，這意味著許多關鍵的細胞結構和分子活動無法直接觀察，成為科學研究的盲區。在生命科學領域，這一限制尤為明顯。許多生物過程發生在亞細胞級別，涉及極其微小的結構和分子。

而且同時，在傳統的顯微成像中，圖像的清晰度也常常因為焦外干擾而受到影響。當顯微鏡在觀察一個樣本時，不僅會捕捉到清晰的焦點圖像，還會把焦點之外的模糊信息一起記錄下來，這會使最終的圖像變得不夠清晰。有兩種較為傳統的方法可以提高圖像的分辨率和清晰度：光片顯微成像和共聚焦顯微成像。

圖 (a)光片顯微成像;(b)共聚焦顯微成像

光片顯微成像的工作原理就像是把一層薄光片投射到樣本上，只照亮特定的一層。避免把焦點之外的模糊信息記錄下來。這就像是用手電筒只照亮書上的某一行文字，而不是整個頁面，從而減少不相關的干擾。光片顯微成像速度快，對樣本的損傷小，非常適合快速捕捉圖像，尤其適用于觀察活體樣本的動態變化。

共聚焦顯微成像則采用了選擇性透光的方法。通過設立一個小孔，只有焦點上的光可以通過，避免焦外的光線干擾成像。相比于傳統的成像方式，共聚焦顯微成像能更好地控制清晰度，還可以實現三維成像，適合研究復雜的組織結構。

盡管光片顯微成像和共聚焦顯微成像都在提高圖像的清晰度上有了一定的改善效果，但它們依然受限于顯微鏡的物理極限，無法分辨比200納米更小的細節。若要進一步探索微觀世界，還需發展更新的技術--超分辨率顯微技術應運而生。這項技術可以分為兩大類：

第一類技術通過光的精密控制來銳化圖像，其中的代表性技術包括受激發射損耗顯微鏡（STED）和結構光照明顯微鏡（SIM）。

圖 受激發射損耗顯微鏡原理圖（左）結構光照明顯微鏡原理圖（右）

受激發射損耗顯微鏡（STED）的核心在于利用激光精確控制熒光分子的發光區域。它的工作原理是通過兩個激光束的配合來控制分子的發光。首先，激發光束將樣品中的熒光分子從基態激發到激發態，使它們具備發射熒光的能力。為了突破衍射極限，STED顯微鏡引入了一束特定形狀的抑制光。這束抑制光專門覆蓋激發光斑的外圍區域，通過受激發射的機制，強制外圍區域內的激發態分子返回基態，從而抑制其熒光發射。

這種受控的激光操作確保了只有中心區域的熒光分子能夠自發輻射熒光，而外圍的熒光被有效關閉。這樣，STED顯微鏡將熒光信號限制在一個更小的空間區域內，從而顯著提升了圖像分辨率。通過調整抑制光的強度和形狀，可以進一步縮小發光區域，理論上能夠將分辨率推至分子級別，遠超傳統光學顯微鏡的衍射極限。受激發射損耗顯微鏡的基本理論是，當用激光照射處于激發態的熒光分子時，激發態的熒光分子吸收一個光子后發射兩個頻率和位相與入射光子相同的光子

圖 STED雙光束原理圖?？梢员茸髟诤诎抵杏檬蛛娡舱樟烈粋€小區域。普通顯微鏡的成像類似于普通手電筒，光照區域較大，因此細小的結構難以分辨清楚。受激發射損耗顯微鏡則通過雙重照明來解決這個問題。首先用一束激發光照亮目標區域，使樣本中的分子發光，然后再用一束淬滅光環繞激發光的外圍。淬滅光就像是一個光學屏障，把外圍的發光區域壓縮掉，只留下中心極小的部分在發光。這樣，成像區域被有效縮小，細節更加集中和清晰，從而實現了更高的分辨率，甚至可以看到小于20納米的細節。

結構照明顯微鏡的原理則不同，它基于一種視覺現象——莫爾效應。當兩組空間頻率接近的周期性光柵圖案相互疊加時，會形成一種更低頻率的干涉圖案。這種條紋是原始高頻信息以低頻形式呈現的結果，使得肉眼可以觀察到原本無法直接分辨的細節。

因為從傅里葉光學的角度來看，圖像可以分解為不同空間頻率的成分，高頻成分代表圖像的細節，低頻成分則描述整體結構。傳統顯微鏡的分辨率限制來源于其無法捕捉高頻成分信息，因為這些成分在光傳播中會以倏逝波的形式快速衰減，導致高頻信息丟失。

在SIM中，研究人員利用正弦條紋或其他結構光來照明樣本。結構光與樣本中的細小結構相互作用，生成干涉圖案。這些圖案將高頻信息混疊到較低頻率范圍，使成像系統能夠捕獲到這些信息。

接下來，SIM再使用算法從頻域中提取出被混疊的高頻信息，將其分離并增強。通過計算將這些頻譜分量重新定位到它們原本的高頻位置。最后，所有信息被拼接到一起，生成一幅超分辨率圖像。相比傳統顯微鏡，SIM能夠將橫向和軸向分辨率提高至兩倍左右。

圖 SIM技術通過在樣本上投射一組細致的光條紋，讓條紋與樣本中的細小結構發生相互作用形成干涉圖案。類似于將不同的條紋圖案層層疊加，再通過計算重建得到超分辨率圖像。這個過程利用了光學傳遞函數（OTF）的概念，因為光學系統本質上是一個低通濾波器，導致傳統顯微鏡無法有效傳遞高頻細節信息。而SIM通過調制光的頻率和相位，迫使樣本中的高頻信息“混疊”到OTF的支持區域。最后，通過算法將這些被轉移的高頻信號從圖像中提取出來，重新組合，生成超分辨率圖像。這種技術能夠提高一倍的橫向和軸向分辨率，且不需要對樣本進行特殊標記，成像速度快，所以廣泛應用于細胞生物學。

第二類超分辨率顯微技術的核心是單分子定位成像，這類技術的原理在于逐步定位每一個分子的精確位置，最終拼接出一幅超高分辨率的圖像。這類技術最典型的代表包括光激活定位顯微術（PALM）和隨機光學重建顯微術（STORM）。這些技術的出現讓我們可以看見遠超傳統顯微鏡分辨率極限的細節。

圖 STORM裝置圖

PALM和STORM是如何做到這一點的呢？假如我們正在拍攝一張大合照，如果一次性拍攝所有人就會導致圖像模糊，但如果想更清晰地看到每個人的樣貌，就可以先聚焦小部分人，拍下這一組，然后再聚焦另一部分人，再拍一張。之后將這些照片疊加起來，這樣最終得到的圖像便能夠清晰呈現每個人的面貌。這正是PALM和STORM技術背后的基本思想。

PALM的全稱是光激活定位顯微術。這種方法的關鍵在于逐層成像。就像前文舉的例子一樣，在PALM顯微鏡中，樣本中的分子不會同時發光，而是分批次地被激活。

STORM（隨機光學重建顯微術）的工作原理與PALM基本相同，但不同之處在于STORM的分子激發過程是隨機的。STORM技術在每一輪成像中會隨機激發樣本中少數分子發光并記錄它們的位置。通過多輪拍攝，將不同位置的分子信號記錄下來，在記錄了足夠數量的定位之后，從測量位置構建高分辨率圖像。這時，最終圖像的分辨率不受衍射的限制。這使得STORM非常適合觀察細胞中的復雜結構，如神經細胞突觸中的分子排列或癌細胞中的特定分子分布。

圖 隨機光學重建顯微鏡原理示意圖

隨著人工智能（AI）和機器學習的發展，超分辨率顯微技術正逐漸與這些技術相結合，以實現自動化分析。AI和機器學習可以用于處理大量的成像數據，自動識別和分離感興趣的分子結構，從而極大地提高分析效率。未來，借助AI，能夠更快速地從超分辨率圖像中提取有用信息，使得數據分析不再依賴人工。

參考文獻

[1]肖文.Z軸漂移自校準的隨機光學重建顯微鏡成像系統研究[D].深圳大學,2020.

曹耀宇, 謝飛, 張鵬達, 等. 雙光束超分辨激光直寫納米加工技術[J]. 光電工程, 2017, 44(12): 1133-1145.

Temma, K., Oketani, R., Kubo, T. et al. Selective-plane-activation structured illumination microscopy. Nat Methods (2024).

來源: 星空計劃

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