一氧化氮（NO）曾普遍被視為一種有毒有害氣體，應(yīng)盡可能遠離。然而，后來的科學(xué)研究揭示它在生物體內(nèi)發(fā)揮極為重要的生理作用，NO是首個被發(fā)現(xiàn)在動物體內(nèi)起到氣體信號分子作用的物質(zhì)。這項開創(chuàng)性的工作是由美國藥理學(xué)家斐里德·穆拉德通過實驗闡明的，最初他意外發(fā)現(xiàn)了含氮物質(zhì)能夠激活特定的酶，進而揭開了硝酸甘油治療心絞痛的機理——即一氧化氮分子介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠促使平滑肌舒張；同時進一步證實了內(nèi)源性NO的存在。本文將主要介紹穆拉德的科研歷程，展示他如何逐步取得這項重大發(fā)現(xiàn)，見證科學(xué)與生命的奇妙邂逅。

撰文 | 郭曉強（河北體育學(xué)院）

提到一氧化氮（Nitric oxide，NO），大家第一印象是一種有毒氣體和環(huán)境污染物，事實也的確如此，但這種看法忽視了它在人體中的重要作用。

NO無色無味，于1779年由英國著名化學(xué)家約瑟夫·普利斯特里（Joseph Priestley）首先發(fā)現(xiàn)，他還發(fā)現(xiàn)一氧化二氮、二氧化氮、氧氣、氨氣、氯化氫等眾多氣體。后續(xù)研究中，NO都被看作大氣污染物，是煙草、柴油和汽油等燃燒副產(chǎn)品，經(jīng)機動車排放、工業(yè)排放和微生物釋放等過程產(chǎn)生。毒理學(xué)實驗顯示，吸入一定量NO（具體數(shù)值可能因條件和個體差異而異）可導(dǎo)致輕度呼吸急促和咳嗽，一段時間后出現(xiàn)支氣管痙攣和肺水腫；吸入高濃度NO會造成燒傷、痙攣、喉嚨組織腫脹、上呼吸道阻塞甚至死亡。工作場所NO濃度允許上限為8小時內(nèi)25ppm（part per million，百萬分之一），當(dāng)達到100ppm時對生命和健康造成嚴(yán)重危險。

直到20世紀(jì)70年代，美國藥理學(xué)家斐里德·穆拉德（Ferid Murad）首先揭示了其有益的一面，并進一步發(fā)現(xiàn)它在體內(nèi)還發(fā)揮著至關(guān)重要的生理功能，NO這個“百害而無一利”的標(biāo)簽才被去除。穆拉德也因此與他人共享了1998年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

斐里德·穆拉德（Ferid Murad，1936.9.14—2023.9.4）

一

志存高遠

1936年9月14日，穆拉德出生于美國印第安納州懷廷市一個移民家庭。父親來自阿爾巴尼亞，以經(jīng)營小雜貨店為生，因此經(jīng)濟條件有限，全家五口擠在一個不滿50平米的小房間。父母辛苦勞作維持生計，每日工作很長時間，這為穆拉德帶來很大影響，他從小就下定決心努力學(xué)習(xí)，以不再像父母這樣辛勞。穆拉德在12歲時就樹立成為一名醫(yī)生的理想，但“事與愿違”的是，穆拉德后來的工作比父母時間更長且更努力，區(qū)別在于不再是僅僅為了生計。

高中畢業(yè)后，穆拉德面臨一大抉擇。由于家庭難以承擔(dān)高額學(xué)費，因此他需要尋找一所能夠提供高額獎學(xué)金的大學(xué)。穆拉德最初決定考取免費的海軍學(xué)院或西點軍校，但這些學(xué)校不講授醫(yī)學(xué)課程，畢業(yè)后的四年兵役會耽擱醫(yī)學(xué)深造。他最終選擇迪堡大學(xué)（DePauw University）。迪堡大學(xué)是一所小型而優(yōu)秀的文理大學(xué)，學(xué)校為穆拉德提供一份獎學(xué)金保障其完成學(xué)業(yè)，這里開設(shè)生物學(xué)和化學(xué)等醫(yī)學(xué)相關(guān)課程，為他進一步醫(yī)學(xué)深造提供了便利。

1957年，大四的穆拉德準(zhǔn)備申請醫(yī)學(xué)院，最初決定去位于圣路易斯的華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院，隨后兩個人的建議讓他徹底改變了主意。一位是穆拉德大學(xué)期間選修科研時的導(dǎo)師福斯特·富勒（Forst Fuller），建議他考慮西儲大學(xué)（Case Western Reserve University）新開設(shè)的基礎(chǔ)和臨床聯(lián)合七年制醫(yī)學(xué)博士課程；另一位是摯友比爾·薩瑟蘭（Bill Sutherland）的父親厄爾·薩瑟蘭（Earl Wilbur Sutherland），他是該課程的發(fā)起人和負(fù)責(zé)人，為穆拉德更詳細(xì)地介紹了課程優(yōu)點，包括免除學(xué)費外加每月2000美元津貼，誘人條件使穆拉德最終選擇西儲大學(xué)。

二

師出無名

在穆拉德進入西儲大學(xué)前，厄爾·薩瑟蘭已取得一項重大發(fā)現(xiàn)。1957年，薩瑟蘭和助手西奧多·拉爾（Theodore Rall）研究腎上腺素促進糖原分解機制時發(fā)現(xiàn)，把腎上腺素添加到完整肝勻漿可促進糖原分解；然后將肝勻漿離心分離成上清液（細(xì)胞質(zhì)部分）和沉淀（細(xì)胞膜部分）兩部分后，僅將腎上腺素再次加入上清液中，未發(fā)現(xiàn)肝糖原分解明顯增加，但重新加入沉淀后，糖原分解活性恢復(fù)，這一結(jié)果表明細(xì)胞膜是腎上腺素發(fā)揮生理活性所必備的。他們進一步使用腎上腺素處理細(xì)胞膜沉淀，同時補充能量分子ATP后生成一種耐熱小分子物質(zhì)，將該物質(zhì)直接加入（不使用腎上腺素）上清部分也可增加糖原分解，最終確定該物質(zhì)為環(huán)腺苷酸（cyclic adenosine 3'5'-monophosphate,cAMP）。薩瑟蘭在此發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上提出著名的“第二信使假說”，即激素作用于細(xì)胞膜特定受體并激活腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）生成cAMP，cAMP進一步發(fā)揮活性實現(xiàn)生理效應(yīng)；在這里激素是第一信使，cAMP為第二信使。薩瑟蘭因這一貢獻獲得1971年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

薩瑟蘭的重大發(fā)現(xiàn)

薩瑟蘭和拉爾聯(lián)合指導(dǎo)穆拉德從事cAMP研究。穆拉德任務(wù)是探索兒茶酚胺對cAMP形成的影響。在此過程中，他發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿可抑制腺苷酸環(huán)化酶，從而減少cAMP生成，這是首次描述激素對cAMP的負(fù)調(diào)控，第二信使假說內(nèi)容更為豐富了。當(dāng)時，第二信使假說領(lǐng)域快速發(fā)展，穆拉德作為見證者幾乎每天能看到新進展和新發(fā)現(xiàn)；他也是參與者，并激發(fā)出巨大科研興趣，最終放棄了原本的醫(yī)生夢。另一方面，從這些研究中，他熟練掌握了cAMP及其他相似化合物的檢測方法，為將來科研打下了良好基礎(chǔ)。

1963年，薩瑟蘭在尿液中發(fā)現(xiàn)一種和cAMP結(jié)構(gòu)高度相似的小分子cGMP（環(huán)鳥苷酸），隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在。薩瑟蘭最初推測二者同樣重要，但事實并非如此：用作研究的激素都通過cAMP介導(dǎo)反應(yīng)，均不依賴cGMP，這便留下一個重要的未解之謎——cGMP的功能是什么？這一問題成為穆拉德將來的科研方向。

1965年，穆拉德獲得博士學(xué)位后進入麻省總醫(yī)院完成2年的實習(xí)工作，隨后加入國立健康研究院從事三年多博士后工作。1970年，弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)系新建一個臨床藥理部門，穆拉德加入并組建自己的科研小團隊，開啟獨立研究。

三

平淡無奇

選擇一個合適研究方向是穆拉德首先需要解決的問題，當(dāng)時可選cAMP和cGMP兩種分子，二者雖然結(jié)構(gòu)極為相似，境遇卻大相徑庭——一個大紅大紫、一個默默無聞；一個風(fēng)光正盛、一個少人問津。穆拉德不想隨波逐流，他秉持“天生我才”理念，既然細(xì)胞可產(chǎn)生cGMP，那cGMP就應(yīng)有獨特作用，只是目前尚未發(fā)現(xiàn)而已。

當(dāng)時已知細(xì)胞有兩類催化cGMP生成的鳥苷酸環(huán)化酶（GC），一類位于細(xì)胞膜，另一類位于細(xì)胞質(zhì)。穆拉德選擇位于細(xì)胞質(zhì)的GC，實驗設(shè)計較為簡單，他將細(xì)胞進行破碎，離心去掉沉淀保留上清，然后觀察不同物質(zhì)對鳥苷酸環(huán)化酶活性的影響，方法是檢測cGMP生成量（穆拉德已熟練掌握）。穆拉德短期內(nèi)也不準(zhǔn)備對酶進行純化（較為耗時），因此使用粗制品進行研究，但需要將大量制備出的剩余樣品及時儲存。當(dāng)時實驗室最常用的蛋白保存試劑為疊氮化鈉，對保存后的樣品進行檢測時，穆拉德意外發(fā)現(xiàn)鳥苷酸環(huán)化酶活性大幅度增加，cGMP生成量顯著升高。這一意外發(fā)現(xiàn)使穆拉德十分驚訝，就把實驗室可用的試劑依次進行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種化合物如羥胺、苯肼和亞硝酸鹽等也顯著激活酶活性，它們擁有一個共同特征，那就是都含氮元素，深入分析發(fā)現(xiàn)它們激活鳥苷酸環(huán)化酶原因在于反應(yīng)中生成了NO。

穆拉德還發(fā)現(xiàn)，這些物質(zhì)不僅增加粗制品鳥苷酸環(huán)化酶活性，而且對完整細(xì)胞也具有活性。當(dāng)使用這些化合物處理平滑肌細(xì)胞，可明顯增加細(xì)胞內(nèi)cGMP含量；重要的是，能進一步引起肌細(xì)胞舒張，而這是血管擴張的基本原理。因此，穆拉德決定進一步測試有實用價值的化合物，這些化合物要含氮并具有血管舒張活性，在此標(biāo)準(zhǔn)下他鎖定治療心絞痛的藥物——硝酸甘油。

四

意外之喜

1847年，意大利化學(xué)家阿斯卡尼奧·索布雷洛（Ascanio Sobrero）首次在實驗室制備出硝酸甘油（許多人都錯誤認(rèn)為硝酸甘油由諾貝爾首先發(fā)現(xiàn)），這是一種揮發(fā)性極強且極易爆炸的液體（索布雷洛本人實驗過程中傷痕累累）；19世紀(jì)60年代，諾貝爾將硝酸甘油進行改進研制出固態(tài)炸藥。令人意想不到的是，不久人們發(fā)現(xiàn)硝酸甘油可用于治療心絞痛，后續(xù)又成功開發(fā)出單硝酸異山梨醇酯、硝普鈉等多種藥物，統(tǒng)稱硝酸鹽血管舒張劑，但藥理一直不詳。

1977年，穆拉德測試硝酸甘油，發(fā)現(xiàn)可增加血管平滑肌cGMP含量并引起肌肉松弛，原因在于它也可產(chǎn)生NO。這項研究有效解釋了硝酸甘油等藥物治療心絞痛的藥理機制，那就是生成NO生成后，由NO提升cGMP含量，從而實現(xiàn)平滑肌舒張。這一發(fā)現(xiàn)直接為新藥研發(fā)指明方向。1986年，輝瑞公司設(shè)立研發(fā)小組篩選治療心絞痛新藥，原理是尋找磷脂酶5（該酶降解cGMP）抑制劑，最終得到西地那非。該藥可有效增加cGMP濃度，具有擴張冠狀動脈和抑制血栓形成的作用。隨后臨床試驗卻發(fā)現(xiàn)西地那非對心絞痛緩解作用非常有限，而意外觀察到對男性勃起功能障礙有奇效，這一偶然發(fā)現(xiàn)促使神藥“偉哥”誕生，穆拉德也因此獲得“偉哥之父”的美譽。

硝酸甘油、NO和cGMP

穆拉德的思想并未簡單停留在硝酸甘油藥理機制，而是進一步提出存在內(nèi)源性NO，即正常細(xì)胞可在激素和神經(jīng)遞質(zhì)等刺激下由自身含氮化合物產(chǎn)生NO，進而通過誘導(dǎo)cGMP生成發(fā)揮生理作用。按照推測，內(nèi)源性NO含量既低，存在時間又短（這一特性避免其毒性發(fā)揮）。當(dāng)時最先進技術(shù)都很難直接檢測NO，一些證據(jù)間接證實內(nèi)源NO存在，但并不太令人信服，因此遲遲未獲科學(xué)界普遍接受，直到另一個偶然發(fā)現(xiàn)。

五

最佳助攻

20世紀(jì)50年代，紐約州立大學(xué)藥理學(xué)家羅伯特·弗奇戈特（Robert Furchgott）研究血管擴張的原因，關(guān)注點是神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿。將乙酰膽堿注射到動物體內(nèi)可引起血管擴張和血壓下降現(xiàn)象，因此他推測乙酰膽堿可引起血管中肌細(xì)胞舒張，從而增加血管直徑。弗奇戈特讓學(xué)生用體外實驗驗證這一推測，他們制備出一系列血管條，然后使用乙酰膽堿處理；如果血管條變長則意味著肌細(xì)胞舒張，奇怪的是結(jié)果重復(fù)性極差，更多情況下出現(xiàn)血管條變短現(xiàn)象，和預(yù)期完全相反，對這一現(xiàn)象一直無法解釋。

1978年，弗奇戈特決定重新研究這個問題，這次實驗者選擇使用血管環(huán)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿處理造成血管擴張，而且結(jié)果非常穩(wěn)定。進一步分析發(fā)現(xiàn)，兩次實驗的差別就在使用的材料上，血管環(huán)不影響血管內(nèi)部的內(nèi)皮細(xì)胞，而血管條制備過程通常會破壞內(nèi)皮細(xì)胞。對此，他們將血管環(huán)內(nèi)部也去掉內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)果用乙酰膽堿處理后，血管也不再擴張；制備保留內(nèi)皮細(xì)胞的血管條用乙酰膽堿處理后則血管舒張，與之前的結(jié)果一致；甚至他們制備出三明治結(jié)構(gòu)，那就是一條血管保留內(nèi)皮，另一條去除，然后放置于一起（內(nèi)皮細(xì)胞居中），用乙酰膽堿處理可造成兩條血管均舒張。這一系列結(jié)果表明乙酰膽堿作用于肌細(xì)胞需內(nèi)皮細(xì)胞生成一種特定中介物，弗奇戈特將其稱為內(nèi)皮來源舒張因子（EDRF）。弗奇戈特?zé)o法分離和確定EDRF是何種物質(zhì)，但它的功能引起穆拉德的巨大興趣，因此與弗奇戈特溝通準(zhǔn)備合作研究，但由于其他原因而被耽擱。

六

殊途同歸

EDRF的發(fā)現(xiàn)引起許多研究人員巨大興趣，世界各地多家實驗室都在嘗試確定EDRF本質(zhì)，后續(xù)研究驚奇地發(fā)現(xiàn)EDRF與NO具有極大相似性。

首先，EDRF和NO生理功能相似性。二者都會導(dǎo)致血管擴張，并且都通過激活鳥苷酸環(huán)化酶生成cGMP實現(xiàn)。這一點和其他證據(jù)促使穆拉德于1986年提出，EDRF就是內(nèi)源NO。

其次，EDRF和NO化學(xué)性質(zhì)相似性。兩種物質(zhì)半衰期都極短，并且都可影響血紅素光譜吸收，且影響結(jié)果分毫不差，而測試的其他任何分子都不具備如此神奇效果。基于此，穆拉德認(rèn)定EDRF就是NO。

1986年，弗奇戈特和加州大學(xué)洛杉磯分校的路易斯·伊格納羅（Louis Ignarro）在第四屆舒張血管機制國際研討會上同時報道這項發(fā)現(xiàn)，遺憾的是大多數(shù)人并不相信他們的結(jié)果。但隨后越來越多的證據(jù)支持EDRF和NO二者的一致性，科學(xué)界逐漸接受了這一事實。

1988年，研究人員證明精氨酸是體內(nèi)NO生成的原料；1990年，研究人員在大腦中獲得催化NO生成的酶，稱為大腦NO合酶（bNOS），又稱NOS-1；1991年，進一步發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞NO合酶（eNOS），又稱NOS-3；在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)型NOS（iNOS），又稱NOS-2。至此，三種NOS鑒定完畢，它們發(fā)揮不同生理功能，分別為舒張血管、抵抗感染和神經(jīng)保護。至此，體內(nèi)存在NO已成科學(xué)事實。

體內(nèi)NO生成

七

功成名就

后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)NO遠比想象中更為重要，它參與了廣泛的生物學(xué)過程，特別是作為動物體內(nèi)第一種氣體信號分子，為其他氣體信號分子如CO、H2S等發(fā)現(xiàn)和研究提供重要思路，1992年，NO被《科學(xué)》雜志評為年度明星分子。

隨著NO重要性日益顯現(xiàn)，穆拉德也開始獲得一系列科學(xué)獎勵。1996年，穆拉德和弗奇戈特分享拉斯克基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)獎；1998年，他們又和伊格納羅分享諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。諾貝爾評獎委員會認(rèn)為，穆拉德有關(guān)NO和cGMP的研究發(fā)現(xiàn)不僅詮釋了一類古老藥物的工作原理，而且還為許多生理現(xiàn)象理解和疾病治療提供新思路。現(xiàn)在已知，NO在炎癥形成、血液循環(huán)、組織發(fā)育、平滑肌舒張和長期記憶等過程均發(fā)揮重要作用，在心臟病、中風(fēng)、癌癥、肺部高血壓等臨床應(yīng)用方面也具有重要潛力，如吸入NO治療患有持續(xù)性肺動脈高壓的早產(chǎn)兒。

八

老而彌堅

穆拉德一直摯愛著自己的科研事業(yè)，執(zhí)著于揭示生命奧秘并期望能造福于人類。

1970年到1981年間，穆拉德在弗吉尼亞大學(xué)工作，于1975年成為學(xué)校最年輕教授之一，1971年成為臨床研究中心主任和1973年臨床藥理學(xué)主任；他建立了一個臨床和基礎(chǔ)相結(jié)合的研究團隊，取得科研成果的同時還培養(yǎng)了一大批青年人，他們成為科學(xué)發(fā)展的后備力量。1981年，穆拉德加入斯坦福大學(xué)，直到1989年。

為了能將科研成果更好轉(zhuǎn)化，穆拉德于1988年加入雅培公司，擔(dān)任副總裁，在隨后的4年間開展新藥研發(fā)和臨床試驗工作，大膽嘗試一些疾病新療法，遺憾的是未達自己預(yù)期而離職。1993年，穆拉德親自成立一家生物技術(shù)公司，擔(dān)任總裁兼首席執(zhí)行官，在未能籌備到足夠資金而自己的投入又花費殆盡的情況下，創(chuàng)業(yè)中道崩殂。

1997年，穆拉德重回學(xué)術(shù)界，加入得克薩斯大學(xué)休斯敦分校，再次開展基礎(chǔ)研究。獲得諾貝爾獎后，穆拉德日程變得繁忙起來，需要參與多種社交活動，因此有機會推廣自己的學(xué)術(shù)理念。穆拉德精力旺盛，在多家單位開展廣泛的研究，2011年時仍加入華盛頓大學(xué)工作。

2023年9月4日，穆拉德在加利福尼亞州門洛帕克去世，享年86歲。

穆拉德科研生涯完美詮釋了生命過程需要“NO（一氧化氮）”，而科研過程更需要 “NO（不）”。不拘泥傳統(tǒng)思維、勇于向陳舊觀念挑戰(zhàn)應(yīng)是偉大科學(xué)家的先天因素。

主要參考文獻

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