近日，上海師范大學生命科學學院蘆銀華研究員團隊在《中國科學：生命科學》英文版發表重要研究成果，首次在非模式工業放線菌中建立了一種基于內源I-B型CRISPR/Cas系統的高效基因組編輯工具，解決了工業放線菌刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）長期面臨的遺傳操作難題，也為其他難以改造的工業微生物提供了新思路。

刺糖多孢菌是生產綠色生物農藥多殺菌素的重要工業菌株。多殺菌素具有高效、廣譜的殺蟲活性，且哺乳動物細胞毒性低、安全性高，是一種“環境友好型”殺蟲劑。然而，刺糖多孢菌轉化效率低、遺傳工具匱乏，導致其代謝工程改造困難重重，產能瓶頸難以解決。依賴外源CRISPR/Cas9系統的基因組編輯技術雖然已在諸多物種取得突破，但針對工業微生物，依然面臨轉化效率低、宿主毒性強等問題，難以廣泛應用。研究團隊另辟蹊徑，巧用細菌“原生剪刀”——內源I-B型CRISPR/Cas系統，通過生物信息學分析和實驗驗證，確定了該系統識別的PAM序列（基因切割的“定位信號”）（圖1）。通過重編程靶向自身基因組的微型CRISPR陣列，建立新型編輯工具，成功實現高效的基因敲除。該方法無需導入外源Cas蛋白，編輯質粒更小、毒性更低。

圖1. 刺糖多孢菌內源Type I-B型CRISPR/Cas系統。

（A）刺糖多孢菌內源CRISPR/Cas系統組成及轉錄分析。（B）I-B型CRISPR/Cas系統組成的Cascade復合體在crRNA引導下靶向DNA示意圖。Cascade復合體由Cas11、Cas8、Cas7、Cas6、Cas5等蛋白組成。在PAM被Cas8識別后，Cascade結合到目標DNA上，招募Cas3在原間隔區內切割目標DNA的非靶向鏈。（C）WebLogo顯示的介導CRISRP/Cas系統DNA切割功能的可能PAM序列。

另外，刺糖多孢菌具有多種RM防御系統，如同“分子守衛”般切割外來DNA，導致質粒轉化效率極低。研究團隊利用新開發的基因敲除工具，逐一敲除關鍵RM系統，得到一株轉化效率顯著提高的工程菌株，這為后續的遺傳操作掃清了障礙。在此基礎上，實現了熒光報告基因mCherry的高效插入，以及長達75 kb的多殺菌素生物合成基因簇的成功敲除（圖2）。這些結果顯示該工具針對單基因以及基因簇強大的編輯能力，為刺糖多孢菌高產育種提供了必要的技術支撐。

圖2. 基于內源CRISPR系統的高效基因組編輯技術應用于外源基因插入及刺糖多孢菌基因簇大片段敲除。

（A）構建敲除質粒，實現對目標基因簇敲除示意圖。（B）基因簇敲除菌落PCR鑒定，上圖為基因簇外側引物PCR驗證，下圖為利用基因簇內部引物PCR驗證。（C）基因簇敲除菌株的Sanger測序驗證。（D）mCherry插入刺糖多孢菌基因組示意圖。mCherry插入菌落PCR鑒定（E）及測序驗證（F）。

來源: 《中國科學》雜志社