Nephrin抗體作為足細胞腎病的一種新型循環滲透因子，被認為在區分免疫因素與非免疫因素相關的MCD（微小病變型腎?。?FSGS（局灶節段性腎小球硬化）方面具有重要價值。然而，目前在Nephrin抗體的檢測與定量方面存在諸多挑戰。人體血清包含上萬種蛋白和抗體，而Nephrin抗體含量極低，易受高豐度蛋白干擾，且易與血清中其他雜質結合，導致假陰性結果。

國際上各Nephrin檢測團隊已報告多種檢測Nephrin抗體的策略，包括利用重組人腎小球基底膜進行免疫沉淀（圖 1A） 、結合信號增強的ELISA與重組人腎小球基底膜（圖 1B，左）、采用傳統 ELISA，以及免疫沉淀結合ELISA法對沉淀的重組腎小球基底膜進行定量的聯合方法（圖 1B，右）等。

**圖1：Nephrin抗體的檢測。(A) 人類血清樣本中Nephrin抗體檢測的免疫沉淀概述。(1) 人類血清與重組腎小球基底膜蛋白孵育以形成抗體-抗原復合物。(2) 加入抗體結合樹脂或珠以沉淀抗體-抗原復合物。(3) 沉淀的蛋白質經洗脫釋放抗體和結合抗原。(4) 凝膠電泳和 western blotting 可用于在沉淀了重組蛋白的樣本中特異性檢測沉淀的腎小球基底膜蛋白。(B）不同ELISA技術在檢測人類血清樣本中Nephrin抗體的概述。(左)信號增強的直接ELISA使用固定化的重組腎小球基底膜，人類抗體與其結合 (A)，并通過生物素連接的抗人類免疫球蛋白G (IgG) 抗體檢測 (B)。然后通過抗生物素蛋白連接的辣根過氧化物酶與其結合 (C)。辣根過氧化物酶催化一種顯色底物的轉化，指示結合的人類抗體的量 (D)。(右)**免疫沉淀后進行ELISA的雜交檢測法，通過其抗生蛋白標簽與streptactin-ELISA板結合，并使用商業化的綿羊來源的Nephrin抗體特異性檢測結合的腎小球基底膜 (4.1) 緊接著是與辣根過氧化物酶偶聯的 secondary 抗綿羊 IgG 抗體的結合 (4.2)，其通過顯色底物 (4.3) 進行定量。

近期，德國Hengel團隊在《CKJ》期刊上發表綜述，深入分析了不同Nephrin抗體檢測方法對臨床研究結果的影響（表 1）。

**表 1：**檢測方法概述及不同研究和隊列中循環Nephrin抗體的檢出率

JASN, 美國腎臟病學會雜志; NEJM, 新英格蘭醫學雜志; KI, 腎臟國際; HEK293, 人胚胎腎細胞293; MN, 膜性腎病; pFSGS, 原發性FSGS; IgAN, IgA腎病; ANCA, 抗中性粒細胞胞質抗體; SLE, 系統性紅斑狼瘡; SSNS, 類固醇敏感性腎病綜合征; SDNS, 類固醇依賴性腎病綜合征; HR, 風險比; CI, 置信區間。

Hengel團隊還對目前已有報道的Nephrin檢測方法的優缺點進行了詳細對比分析：

一、免疫共沉淀法（Co-IP）

相較于傳統抗體檢測方法，展現出顯著優勢：（1）高靈敏度，通過抗體結合樹脂/珠富集和純化患者抗體，能夠有效檢測低水平循環自身抗體；（2）高特異性，陽性結果需兩個獨立抗體 - 抗原復合物形成（血清自身抗體結合溶液中靶抗原，且靶抗原特異性抗體檢測沉淀抗原），盡管理論上抗原結合樹脂可能存在風險，但可通過適當程序加以控制，并且結合Western Blot檢測可進一步利用抗原分子量信息提升特異性，減少假陽性；（3）能夠檢測弱相互作用，在天然條件下（無變性劑/還原劑或抗原固定）形成抗原-自身抗體復合物，避免了因Western樣品制備或ELISA等過程導致的表位結合減少或喪失。這些特點使得Co-IP在檢測自身抗體，尤其是低水平抗體方面表現出色。然而，其也存在一些局限性，如高樣品需求（例如30μL/ 檢測）、操作繁瑣且耗時較長，以及僅能通過Western Blot進行半定量。

二、標準 ELISA

標準ELISA（如使用重組腎小球因子包被）具有操作簡便、通量高、樣品需求低（通常1-2μL/檢測）且可通過標準曲線定量抗體等優點。但多項研究顯示，標準ELISA未能可靠定量Nephrin抗體，可能是因為Nephrin抗體含量過低，需額外信號放大步驟，而信號放大可能增加非特異性信號，進而導致假陽性結果。

三、免疫共沉淀結合ELISA法

免疫共沉淀結合ELISA法通過對沉淀的重組Nephrin進行定量（圖 1B，右），可在一定程度上克服兩種方法的缺陷，實現對Nephrin滴度的敏感和特異性定量測量。不過，這種方法仍需大量手工操作，且對樣本量的要求比標準ELISA法更高。

四、其他有關Nephrin抗體的檢測方法

其他有關Nephrin抗體的檢測方法也存在諸多缺陷：一是使用商業化重組腎小球足蛋白或不同的蛋白質標簽，由于其與人類表達的腎小球足蛋白不同，或表達系統信息缺乏，導致高假陽性結果；二是對冷凍腎活檢標本進行IgG和腎小球基膜的共染色及共定位，這種技術僅通過共定位提示一個可能的抗原，并未明確指出IgG的目標抗原是腎小球基膜；三是基于細胞的熒光技術，雖然可以模擬Nephrin抗體在細胞膜附近結合的條件，但與腎小球濾過屏障的原生裂孔處的局部條件仍存在較大差異。

綜合來看，基于抗體捕獲和富集路徑的Nephrin抗體檢測方法，可以提升Nephrin抗體檢測的穩定性和可重復性，從而在診斷、預后和治療指導方面帶來潛在益處。國內奧根診斷研發的Super Nephrin Antibody Trap（SuperNAT）二代高靈敏Nephrin抗體檢測方案，基于SuperNAT技術的抗體富集平臺，顯著降低Nephrin抗體檢測的背景噪音，比傳統ELISA法檢出率提高了53%。

來源: 奧根診斷官網